PCR基因擴增實(shí)驗室建設

    PCR基因擴增實(shí)驗室介紹和標準：

    PCR實(shí)驗室又叫基因擴增實(shí)驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱(chēng)。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過(guò)DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別。

    PCR實(shí)驗室必須建立嚴格的實(shí)驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實(shí)驗室衛生安全，確保實(shí)驗室長(cháng)期穩定運行.

PCR設計規范 /PRINCIPLES

配置原則	室全PCR線(xiàn)實(shí)驗(高檔實(shí)驗室)	標準PCR實(shí)驗室（中檔實(shí)驗室）	普通實(shí)驗室（普通實(shí)驗室）	測序實(shí)驗室（專(zhuān)科實(shí)驗室）
開(kāi)展項目	涵蓋了目前分子生物學(xué)能開(kāi)展所有項目，達到國內甚至國際一流CR實(shí)驗室水平。	檢測項目齊全，涵蓋了目前臨床需求的常規檢測項目，達到國內PCR標準實(shí)驗室的檢測水平。	臨床科室或小型醫院開(kāi)展PCR項目，檢測項目滿(mǎn)足臨床需求，達到或達不到國內PCR標準實(shí)驗室的標準。	開(kāi)展測序的所有檢測項目，達到標準PCR實(shí)驗室水平
項目先進(jìn)性	除開(kāi)展常規的檢測項目外，還需開(kāi)展高端項目，如測序項目、超敏PCR項目、腫瘤檢測等高端項目。	開(kāi)展項目技術(shù)性能基本滿(mǎn)足臨床需求，達到國內PCR標準實(shí)驗室的檢測水平。	開(kāi)展項目技術(shù)性只能滿(mǎn)足科室或小型醫院的當前需求，不具有先進(jìn)性。	國內外最先進(jìn)的PCR測序檢測項目，達到個(gè)體化診療的需求。
人員要求	至少有兩人，除經(jīng)過(guò)普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實(shí)驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過(guò)普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實(shí)驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過(guò)普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實(shí)驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過(guò)普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實(shí)驗及結果分析能力。

PCR基因擴增實(shí)驗室技術(shù)參數：

區域	壓力	溫度	相對濕度	照明
PCR走廊	+5-0Pa	20-26度	40-60%RH	主實(shí)驗室≥300LX，其余房間20-300LX
PCR試劑準備區	+10Pa
PCR樣品制備區	+15Pa
PCR擴增及擴增產(chǎn)物分析區	-15-250Pa

基因擴增檢驗實(shí)驗室平面布局
 1）臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室區域設置原則

1、 試劑儲存和準備區  

2、 標本制備區

3、 擴增反應混合物配制和擴增區

4、 擴增產(chǎn)物分析區（如使用全自動(dòng)分析儀，區域可適當合并。）

  2） 各工作區域必須有明確的標記，避免不同工作區域內的設備、物品混用。
  3） 進(jìn)入各工作區域必須嚴格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲存和準備區 —>標本制備區—>擴增反應混合物配制和擴增區—>擴增產(chǎn)物分析區。
 4） 不同的工作區域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開(kāi)各工作區域時(shí)，不得將工作服帶出。

PCR擴增檢驗實(shí)驗室原則上分為三個(gè)單獨的工作區域：試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增和擴增產(chǎn)物分析區。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區域必須嚴格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增和擴增產(chǎn)物分析區。各實(shí)驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。

(1)試劑貯存和準備區
該實(shí)驗區主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應直接運送至該區，不得經(jīng)過(guò)其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區應對外界保持微正壓。

　(2)標本制備區
該區域主要進(jìn)行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定DNA的合成。本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進(jìn)入本區的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì )發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動(dòng)。

(3-4)擴增和擴增產(chǎn)物分析區
　　該區域主要進(jìn)行的操作為DNA擴增和擴增片段的測定。此外，已制備的DNA模板(來(lái)自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進(jìn)行。本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應在超凈臺內進(jìn)行。

   PCR區完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專(zhuān)門(mén)用于這一目的，決不能把實(shí)驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。產(chǎn)物分析區如使用全自動(dòng)分析儀，區域可適當合并。

(5)緩沖區與沖洗區
整個(gè)區域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨立實(shí)驗區設置有緩沖區，同時(shí)各區通過(guò)氣壓調節，使整個(gè)PCR實(shí)驗過(guò)程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

可打開(kāi)緩沖區Ⅰ，緩沖區Ⅱ和 PCR 擴增區的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗區的外墻上和各扇門(mén)上都安裝有風(fēng)量可調的回風(fēng)口，空氣通過(guò)回風(fēng)口向室內換氣。外面有用于實(shí)驗后消毒，消毒區域有專(zhuān)用清洗液和專(zhuān)用潔凈洗手池，以及消毒紙巾。

若房間進(jìn)深允許，可設PCR內部專(zhuān)用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專(zhuān)用走廊更有意義。
    各個(gè)區域之間應具備單向的實(shí)驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實(shí)驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實(shí)驗過(guò)程造成污染產(chǎn)生假性結果。

PCR實(shí)驗室建設

1、主體結構：
主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽(yáng)角均采用鋁合金50內圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問(wèn)題。結構牢固，線(xiàn)條簡(jiǎn)明，美觀(guān)大方，密封性好。
 2、 標準的三區分隔和氣壓調節：
將PCR過(guò)程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增、分析三個(gè)（或）四個(gè)獨立的實(shí)驗區。整個(gè)區域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨立實(shí)驗區設置有緩沖區，同時(shí)各區通過(guò)氣壓調節，使整個(gè)PCR實(shí)驗過(guò)程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
可打開(kāi)緩沖區Ⅰ，緩沖區Ⅱ和 PCR 擴增區的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗區的外墻上和各扇門(mén)上都安裝有風(fēng)量可調的回風(fēng)口，空氣通過(guò)回風(fēng)口向室內換氣。

3、 消毒：
在三個(gè)實(shí)驗區和三個(gè)緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區和標本制備區 還設置移動(dòng)紫外線(xiàn)燈，對實(shí)驗桌進(jìn)行局部消毒。
4、 機械連鎖不銹鋼傳遞窗：
試劑和標本通過(guò)機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。
5、 地面
地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。

6、 照明
燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。

PCR實(shí)驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實(shí)驗，通常應經(jīng)過(guò)試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個(gè)實(shí)驗過(guò)程，若實(shí)驗工藝需要，還應增加樣品粉碎過(guò)程。
一、分散形式PCR實(shí)驗室
    所謂分散形式PCR實(shí)驗室，是指完成上述實(shí)驗過(guò)程的實(shí)驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實(shí)驗室，由于各個(gè)實(shí)驗之間不易相互干擾，因此無(wú)需特殊條件要求。

二、組合形式PCR實(shí)驗室
    所謂組合形式PCR實(shí)驗室, 是指完成PCR四個(gè)實(shí)驗過(guò)程的實(shí)驗用房相鄰布置，組成獨立實(shí)驗區域的形式。對于組合形式PCR實(shí)驗室，由于各個(gè)實(shí)驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統具有一定的要求。各室在入口處設緩沖間，以減少室內外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；核酸擴增室及產(chǎn)物分析室應呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品。
如果使用熒光PCR儀，擴增室和產(chǎn)物分析室可以合并。
    若房間進(jìn)深允許，可設PCR內部專(zhuān)用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專(zhuān)用走廊更有意義。
    各個(gè)區域之間應具備單向的實(shí)驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實(shí)驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實(shí)驗過(guò)程造成污染產(chǎn)生假性結果。  
實(shí)驗室的墻體，包括頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線(xiàn)條過(guò)渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿(mǎn)足無(wú)縫隙、無(wú)滲漏、光潔、耐腐蝕的要求.。

PCR實(shí)驗室各區域管理規定：

試劑準備區工作制度  
 一、實(shí)驗人員進(jìn)入該區須更換工作服，穿本區專(zhuān)用綠色工作服， 戴帽子、口罩及更換專(zhuān)用拖鞋。 
二、實(shí)驗員在試劑準備區接收標本、準備實(shí)驗用的試劑。
 三、實(shí)驗員每天收齊標本，驗收登記后，將標本通過(guò)傳遞 窗送入標本制備區。  四、在試劑準備區配置好試劑后放入冰箱內備用。需要時(shí) 通過(guò)傳遞窗送入標本制備區。 
五、每天的標本及配置的試劑須登記記錄，應書(shū)寫(xiě)工整詳 細，使用本區專(zhuān)用的、帶有本室標識的記錄本、紙和筆。
 六、將本區廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專(zhuān)人將垃圾帶出 實(shí)驗室交醫院集中處理。
 七、實(shí)驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。

標本制備區工作制度   
 一、實(shí)驗人員進(jìn)入該區須更換工作服，穿上本區專(zhuān)用藍色工作服， 戴帽子、口罩及更換專(zhuān)用拖鞋。
 二、把已準備好的試劑放入冰箱試劑存放專(zhuān)區暫存。
 三、記錄溫濕度計讀數、冰箱的溫度。
 四、嚴格按照SOP文件及試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗操作，加樣好的PCR 管須通過(guò)傳遞窗送入擴增及產(chǎn)物區。
 五、使用本區專(zhuān)用的移液器及吸頭，使用過(guò)的離心管、吸頭須置于 盛有含氯消毒液的廢液缸中，實(shí)驗完畢后及時(shí)處理。將本區廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專(zhuān)人將垃圾帶出實(shí)驗室交醫院集中處理。
 六、使用本區專(zhuān)用的帶有本區標識的記錄本、紙和筆，其他區的用 品不得帶入本區。 
七、實(shí)驗完畢關(guān)閉所有儀器，記錄儀器使用時(shí)間和運行狀態(tài)。
 八、實(shí)驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。     

擴增及產(chǎn)物分析區工作制度  
  一、實(shí)驗人員進(jìn)入該區須更換工作服，穿上本區專(zhuān)用粉紅色 工作服，戴帽子、口罩及更換專(zhuān)用拖鞋。
 二、記錄溫濕度計讀數、冰箱的溫度。
 三、本區主要進(jìn)行目的基因的擴增及分析，須熟悉各擴增儀 的使用，擴增分析完后，記錄結果。
 四、得到當天室內質(zhì)控結果后，及時(shí)記錄在室內質(zhì)控圖上并 進(jìn)行分析。
 五、試驗完畢后關(guān)掉擴增儀，記錄儀器使用時(shí)間和運行狀態(tài)。
 六、每周由實(shí)驗室負責人對進(jìn)行清潔維護并記錄。
 七、擴增分析完后的反應管，須裝入本室垃圾袋中，有專(zhuān)人 將垃圾帶出實(shí)驗室交醫院集中處理。 
八、使用本區專(zhuān)用的帶有本區標識的記錄本、紙和筆，其他區的用 品不得帶入本區。
 九、實(shí)驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗臺面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。

PCR實(shí)驗室在操作時(shí)應注意事項

PCR（基因擴增實(shí)驗室）檢測微量感染因子時(shí)，操作人員容易因為污染而導致各種問(wèn)題。進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員一定要嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染事故的發(fā)生。 

一、PCR實(shí)驗室劃分操作區： 

  目前，對于普通PCR，業(yè)內還無(wú)法做到單人單管和實(shí)現完全封閉管理操作，但無(wú)論是否能夠達到單人單管，均要求實(shí)驗操作在三個(gè)不同的物理區域內進(jìn)行，PCR的前處理和后處理一定要設計在不同的隔離區內進(jìn)行： 

1、標本處理區，包括：  擴增摸板制備;

2、PCR擴增區，包括：  反應液的配制和PCR基因擴增;

3、產(chǎn)物分析區，包括：凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。  

各工作區要具有一定的隔離，操作器材要專(zhuān)用，而且要有一定方向性，如，標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→④產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區的產(chǎn)物及器材嚴禁拿到前后兩個(gè)工作區，避免交叉污染。 

二、PCR實(shí)驗室試劑分裝要求： 

  PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的負壓工作臺或超凈工作臺進(jìn)行配制和分裝，所有的吸頭和加樣器都需固定放于其中，吸頭不能用來(lái)吸取擴增后的DNA和其它來(lái)源DNA：  

 1、PCR用水應為高壓的雙蒸水;

 2、引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴增產(chǎn)物區配制;

 3、引物和d-NTP應分裝儲存，分裝時(shí)應標明分裝時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)及時(shí)查找原因和追溯污染源頭;

  三、PCR擴增重要標準

 1、PCR實(shí)驗靈敏度

  PCR實(shí)驗靈敏度：是指PCR擴增反應能夠檢測到目的基因的最小值。研究結果表明，影響PCR擴增效率的因素，有模板的完整性、反應溫度、復雜程度、引物純度及其與模板結合效率、DNA聚合酶的熱穩定性與擴增性能、反應緩沖液的離子組成(主要指： 陽(yáng)離子)、反應優(yōu)化劑等，這些因素都顯著(zhù)影響

PCR實(shí)驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下，常規PCR反應能夠檢測到pg(10～12g)數量級目的基因。對于一個(gè)特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應體系(包括DNA聚合酶與反應緩沖液等)就是研究者提高PCR實(shí)驗靈敏度的關(guān)鍵因素了。  

2、PCR實(shí)驗特異性

  PCR實(shí)驗特異性：是指在PCR擴增過(guò)程中，專(zhuān)一性擴增目的片段而非其他

片段的性能。 

    在PCR實(shí)驗本身的靈敏度很高，且實(shí)驗條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會(huì )在目的片段出現同時(shí)伴隨有其它雜帶，即發(fā)生非特異性擴增現象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應條件控制等均會(huì )影響PCR擴增特異性。近年來(lái)的研究結果表明，緩沖液品質(zhì)(如反應優(yōu)化劑、離子種類(lèi)與組成等)對保證PCR特異性擴增起著(zhù)重要作用。  

 3、PCR靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)

  PCR實(shí)驗靈敏度與特異性是一對此長(cháng)彼消特性，這也決定我們實(shí)驗體系調節實(shí)際上就是需要找到適合實(shí)驗靈敏度與特異性的平衡點(diǎn)。由于PCR體系中的成分眾多，使得組合較多，篩選工作也就相對繁雜。四、PCR實(shí)驗操作注意事項：  

  盡管PCR擴增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應導致的，但樣品間的交叉污染也是常見(jiàn)原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴增反應時(shí)要謹慎對待，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節都應謹慎操作，一般需做到以下幾點(diǎn)： 

 1、戴一次性手套，若不小心濺上反應液，應立即更換手套;

 2、避免反應液飛濺，若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

 3、使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(cháng)時(shí)間暴露于空氣中，避免空氣中氣溶膠的污染;

4、操作多份樣品時(shí)，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后再分裝，這樣既可以減少操作次數，避免污染，又可以增加反應的精確度； 

5、最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管;

6、操作時(shí)設立空白對照和陰陽(yáng)性對照，既可驗證PCR反應的可靠性，又可

 以協(xié)助判斷擴增系統的可信性;

7、由于實(shí)際操作時(shí)加樣器很容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，所以操作者最好使用高壓處理過(guò)的或可替換的加樣器。 假如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少在PCR操作過(guò)程中加樣器應該專(zhuān)用，嚴禁交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)相鄰區域使用;

8、重復實(shí)驗，驗證結果，慎下結論。 

五、綜述： 

  由于PCR實(shí)驗操作非常專(zhuān)業(yè)，在設計PCR基因擴增實(shí)驗室時(shí)設計師也要充分考慮上述技術(shù)要求，避免PCR實(shí)驗室在后續使用時(shí)出現返工、返修問(wèn)題。